三 微生物的生长

在代谢的基础上，微生物的个体会由小到大不断地生长。但是，对于单细胞微生物来说，个体的生长很不明显，持续很短时间就开始繁殖，而且生长和繁殖交替进行，界限难以划清。因此，在实际工作中，常以微生物的群体为单位来研究微生物的生长。那么，微生物的群体具有什么样的生长规律呢？

微生物群体生长的规律

下面以细菌为例讲述微生物群体生长的规律。将少量的某种细菌接种到恒定容积的液体培养基中，定时取样测定培养基里的细菌数目。然后，以时间为横坐标，以细菌数目的对数为纵坐标作图，便可以得到反映细菌生长规律的曲线，叫做生长曲线(如图)。从图中可以看出，细菌群体从开始生长到死亡的动态变化可以分为以下四个主要时期。

调整期 刚刚接种到培养基上的细菌，对新环境有一个短暂的调整或适应过程，因此，一般不立即开始分裂繁殖，这段时间称为调整期。这时细菌的代谢活跃，体积增长较快，大量合成细胞分裂所需的酶类、ATP以及其他细胞成分。调整期的长短与菌种、培养条件等因素有关。

对数期 这个时期的细菌进入快速分裂阶段，细胞数目以等比数列的形式增加：1→2→4→8……即2⁰→2¹→2²→2³……因此，一个细菌繁殖n代，可以产生2ⁿ个细菌。处于对数期的细菌，代谢旺盛，个体的形态和生理特性比较稳定，常作为生产用的菌种(也叫种子)和科研的材料。

稳定期 经过一段时间的高速生长以后，随着营养物质的消耗，有害代谢产物的积累，pH的变化等，细菌的分裂速率下降，死亡细胞的数目逐渐增加，整个培养基中新增加的细胞数和死亡的细胞数达到动态平衡，这个时期称为稳定期。在稳定期，活菌数目达到最高峰，细胞内大量积累代谢产物，特别是次级代谢产物，某些细菌的芽孢也是在这个时期形成的。

衰亡期 随着培养的继续，细菌的死亡速率超过繁殖速率，最终导致培养基中的活菌数目急剧下降，这个时期称为衰亡期。到了衰亡期，细胞会出现多种形态，甚至畸形，有些细胞开始自溶，释放出代谢产物等。

认识和掌握微生物的生长曲线，具有重要的实践意义。例如，处于对数期的细菌，生长繁殖速率快，代谢旺盛，因此，生产上常用这个时期的细菌作为菌种，以缩短生产周期。又如，进入稳定期后，抗生素等代谢产物逐渐增多，这时如果适当补充营养物质，就有助于延长稳定期、提高代谢产物的产量。为此，人们经过长期的探索，总结出一种连续培养的方法，就是在一个流动装置中(如图)，以一定的速度不断地添加新的培养基，同时又以同样的速度不断地放出老的培养基，以保证微生物对营养物质的需要，并排出部分有害代谢产物，使微生物保持较长时间的高速生长。目前，这种方法已成功地应用于酒精、丙酮、丁醇等产品的生产中。连续培养缩短了培养周期，提高了设备利用率，并且便于自动化管理。

微生物群体生长的测定

在生产上，为了掌握培养基中微生物的生长状况，需要定时取样进行测定。常用的测定方法有两种：一种是测微生物的细胞数目，如将单细胞微生物的样品按一定比例稀释后，置于血球计数板上，直接在显微镜下观察计数，然后计算出总菌数。另一种是测重量，如取一定体积的培养基，经离心分离、反复洗涤后，称菌体的湿重，或烘干后称干重，再由此计算出其中的细胞总重量。

影响微生物生长的环境因素

环境中影响微生物生长的因素很多，主要的有温度、pH和氧。

温 度 每种微生物只能在一定的温度范围内生长，其中，微生物生长最旺盛时的温度叫最适生长温度，绝大多数微生物的最适生长温度为25～37℃。在最适生长温度范围内，微生物的生长速率随温度的上升而加快。超过最适生长温度以后，微生物的生长速率会急剧下降，这是由于细胞内的蛋白质和核酸等发生了不可逆的破坏。

pH 每种微生物的最适pH不同，如多数细菌的最适pH为6.5～7.5，真菌的最适pH为5.0～6.0。超 过最适pH范围以后，就会影响酶的活性，细胞膜的稳定性等，从而影响微生物对营养物质的吸收等。

氧 有些种类的微生物只能生活在有氧的条件下，如多种细菌和大多数真菌等好氧型微生物。有些种类的微生物在生活过程中不需要氧气，属于厌氧型微生物，如某些链球菌等。有些厌氧型微生物甚至是严格厌氧的，它们即使短时间接触空气，也会造成生长停滞，甚至导致死亡，如某些产甲烷杆菌。在自然界中，还有一类兼性厌氧微生物，它们在有氧和无氧条件下，能以不同的代谢方式生长繁殖，如酵母菌。可见，环境中氧含量的状况，对不同代谢类型的微生物群体的生长，具有不同的影响。

一、填充题

1．在一定的容器内，微生物的群体生长可以分为______、______、______和______四个时期。

2．微生物的初级代谢产物一般是在______期产生的。

二、选择题

1．微生物产生次级代谢产物的最佳时期是：[ ]

A．对数期； B．稳定期； C．衰亡期； D．调整期。

2．下列对连续培养优点的叙述，不正确的是：[ ]

A．能及时补充微生物所需的营养物质，提高产量；

B．有利于微生物尽快将代谢产物释放到培养基中；

C．能消除不利于微生物生长的某些环境因素；

D．提高了设备利用率。

三、简答题

1．试举例说明研究微生物群体生长规律在生产实践上的意义。

2．氧对不同代谢类型的微生物群体的生长有什么样的影响？为什么？

3．请设计一个实验，来测定微生物生长所需的最适pH。

食品的保存

我们都有这样的生活经验，食品放置一段时间后就会腐败变质。这是微生物在食品中大量繁殖的结果。那么，怎样才能在不影响食品的营养价值和风味的情况下，消灭或抑制其中的微生物，从而延长食品的保存期呢？目前，常用的保存食品的方法有罐藏法、巴氏消毒法、冷藏法、干燥法，以及在食品中加防腐剂等。

罐藏法 17世纪初，一位法国商人发现，将食物加热后立即封藏在玻璃瓶中，食物就可以保存较长时间。现代化的罐头生产设备虽复杂，但生产的原理基本相同。先将食品进行短时间的高温高压处理，然后，放入已经消毒的金属或玻璃罐中，并在真空下封口。由于食品中的微生物已被杀死，外界的微生物又无法进入，因此罐中的食品可以保存较长的时间。

巴氏消毒法 19世纪中期，法国的葡萄酒酿造业十分发达，但酒类变质事件时有发生，使酒厂蒙受了巨大的损失。巴斯德经过研究发现，这是由于酒中污染了杂菌。那么，如何除去这些杂菌呢？通过反复试验，巴斯德发明了既不影响酒的风味，又能杀死酒中杂菌的方法，人们称之为巴氏消毒法。具体做法就是将酒加热到50～60℃，保持30min。如今，这种消毒方法仍广泛用于食品工业，如对牛奶、啤酒等的消毒。

冷藏法 这是商场和家庭普遍采用的食品保存法，冷藏的温度一般在0～10℃。但这时，一些低温型微生物仍能生长并导致食物缓慢变质。近些年来，随着速冻技术的发展，使一些“家常便饭”(如饺子、包子等)走进商场，为人们提供了极大的方便。具体做法是，将食品在短时间内迅速降温至-18℃，然后放入冰柜保存较长一段时间。

干燥法 把刚收获的粮食晒干，将新鲜的鱼虾、水果风干……这些都是通过减少食品中的含水量，来阻止其中的微生物生长。现在，人们可以通过一些先进设备对食物进行干燥处理，如先将食品速冻，使其中的水分结成冰，然后降压，冰就会直接升华为水蒸汽，从食品中逸出。方便面、咖啡等多是用这种方法制造的。

加防腐剂 在食品中加入对人体无毒副作用的防腐剂，也能抑制食品中微生物的生长。

学习细菌培养的基本技术

实验原理

根据某种细菌的营养需要而选择多种原料配制而成的培养基，不仅含有这种细菌生长繁殖所需要的各种营养物质，还要有适宜的pH。本实验所用的牛肉膏蛋白胨培养基，应用较广泛，适于芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等多种细菌的培养。

配制好的培养基必须经过灭菌。灭菌是指杀死一定环境中所有微生物的细胞、芽孢和孢子。对不同的材料，应当采取不同的灭菌方法。培养基一般采用高压蒸汽灭菌法，就是将待灭菌的培养基放入密闭的高压蒸汽灭菌锅内，通过加热使锅内的水沸腾并产生水蒸汽。当水蒸汽将锅内的冷空气排尽以后，关闭排气阀并继续加热，这时锅内的压力就会升高，最终使菌体蛋白质凝固变性，从而达到灭菌的目的。接种环是用火焰烧灼灭菌的。

将某种细菌接种在彻底灭菌的培养基上，经过一段时间的培养后，就能够得到生长良好的细菌群体，它们在培养基上会呈现出一定的形态特征。

目的要求

1．通过对牛肉膏蛋白胨培养基的配制，了解配制培养基的一般步骤和方法。

2．了解灭菌的基本原理，以及实验室中常用的灭菌方法。

3．初步学会细菌培养的基本技术。

材料用具

芽孢杆菌或金黄色葡萄球菌、牛肉膏、蛋白胨、琼脂。

天平、角匙、200mL烧杯、试管、漏斗、量筒、玻璃棒、滴管、胶管、弹簧夹、铁架台、酒精灯、石棉网、三角架、火柴、纱布、棉花、牛皮纸、线绳、标签、接种环、精密pH试纸(或pH计)、金属小筐、高压蒸汽灭菌锅、恒温箱。

NaCl、1mol/L的NaOH溶液、体积分数为75％的酒精溶液、蒸馏水。

方法步骤

一、培养基的配制

1．称量 用天平称取0.5g牛肉膏、1g蛋白胨、0.5gNaCl、2g琼脂。将称好的牛肉膏、蛋白胨和NaCl放入烧杯。

2．溶化 向上述烧杯中加入蒸馏水100 mL，用玻璃棒搅匀后，放到酒精灯上加热。当牛肉膏和蛋白胨溶化后，加入琼脂，并继续用微火加热。在琼脂溶化的过程中，要控制火力的大小，并且不断搅拌，以免培养基溢出或烧焦。待琼脂完全溶化后，补加蒸馏水至100mL。

3．调pH 用滴管逐滴滴入1mol/L的NaOH溶液，边滴边搅拌，并随时用pH试纸测pH，直到pH为7.4～7.6为止。

4．培养基的分装 按右上图所示，将培养基趁热分装到洁净的试管中，培养基的高度约为试管高度的1/5。注意：分装时不要将培养基沾在管口和试管上段，以免引起污染。

5．加棉塞 培养基分装完毕以后，在管口上加一个棉塞。棉塞能防止杂菌污染，保证通气良好。加棉塞时，应使棉塞长度的2/3在试管口内，如下图所示。

6．包扎 每10支试管用线绳捆成一捆，并且在管口外面包上一层牛皮纸，然后，用线绳扎好。在每捆试管外挂上标签，注明培养基名称、配制日期和制作者姓名。

二、灭菌

1．打开高压蒸汽灭菌锅，将里面的灭菌桶取出，向锅内加水(最好用开水)，水面与底架平齐为宜。高压蒸汽灭菌锅的构造如右下图所示。

2．将扎好的试管管口向上竖放在灭菌桶内，再将灭菌桶放回灭菌锅。注意：灭菌桶内的物品不能放得太挤，否则会影响灭菌效果。

3．加盖，并将排气软管插入灭菌桶的排气槽内。以两两对称的方式，同时旋紧相对的两个紧固螺栓，以防漏气。

4．排出锅内的冷空气。接通电源，当压力上升到49kPa时，打开排气阀放气，当压力降到0时，关闭排气阀。重复上述放气过程一次，以彻底排出锅内的冷空气。

5．当锅内的压力上升到98kPa时，控制火力大小，使压力维持在98kPa左右20min，切断电源。

6．当压力降至0以后，打开排气阀，10min以后，旋松紧固螺栓，取出试管。最后，将灭菌锅里的水排放干净。

三、搁置斜面

当培养基冷却至50℃左右时，将试管带棉塞的一端搁在一根木棒上。搁置的长度要合适，使培养基形成的斜面的长度不超过试管总长的一半。

四、接种

1．用肥皂将双手洗净，擦干，再用酒精(体积分数为75%)棉球擦拭双手。

2．当手上的酒精挥发完毕后，点燃酒精灯。注意：一定要等手上的酒精挥发完毕后，再点燃酒精灯，否则，容易将手烧伤。

3．接种，操作程序见下图。注意：整个实验操作过程都要非常小心，不要碰翻酒精灯，以免烧伤。

4．熄灭酒精灯。实验后的带菌培养基，如果用的是致病菌，必须经高压蒸汽灭菌锅灭菌后方能倒掉；如果是非致病菌，也要经加热后再倒掉。

5．接种完毕，将所接菌种、接种日期、接种者姓名填写在标签上。

五、培养

将接种后的试管放入恒温箱内，在25℃下培养5～7d，或在37℃下培养24h。

结论

斜面培养基上的细菌生长状况如何？将观察到的结果和得出的结论填写在《实验报告册》上。

讨论

1．在高压蒸汽灭菌开始以前，为什么要将灭菌锅内的冷空气排尽？

2．灭菌完毕以后，如果压力未降到0就打开排气阀，会出现什么现象？为什么？

3．接种操作为什么一定要在火焰旁边进行？

参考答案

参考答案

大肠杆菌分解乳糖的酶主要是半乳糖苷酶。编码半乳糖苷酶的基因是基因laoZ。基因laoZ的表达过程详见选修课本第三章中“原核生物基因表达的调控”部分。

参考答案

1．在高压蒸汽灭菌以前，如果高压蒸汽灭菌锅内的冷空气没有排尽，当压力上升到 98 kPa时，锅内的温度就不会上升到应有的高度，导致灭菌不彻底。

2．如果压力未降到零就打开排气阀，试管内的培养基就会冲出管口。这是因为高压蒸汽灭菌锅内外压力不平衡的缘故。

3．空气中存在有大量的微生物，而接种灯的火焰旁能形成一个无菌区域，在这里操作，可以避免杂菌污染。